Étude de l'oligomérisation et de la fonction de canaux ioniques par spectroscopie de fluorescence et fluorométrie de voltage imposé.
La communication entre les cellules du corps humain est contrôlée par diverses protéines localisées dans la membrane cellulaire. Celles-ci dictent le flux d’information traversant la membrane cellulaire, qui est à elle seule une barrière pour les ions, hormones, sucres, neurotransmetteurs, macromolécules et plusieurs molécules de nature polaire. Parmi ces protéines membranaires, les canaux ioniques sont présents dans la membrane de toutes les cellules. Ces protéines contrôlent la perméabilité membranaire des ions, qui diffusent suivant leur gradient électrochimique. Ce courant ionique est notamment à l’origine du potentiel de repos des cellules, source énergétique essentielle à leur fonctionnement. Les canaux localisés dans les cellules excitables occupent un rôle particulièrement important, alors qu’ils sont responsables des potentiels d’action nécessaires au système nerveux et cardiaque ainsi qu’à la contraction musculaire. La fonction des canaux ioniques est finement régulée par des changements structuraux de sites clés contrôlant l’ouverture du pore. Ces modulations structurales découlent de l’interaction du canal avec l’environnement local, puisque certains domaines peuvent être suffisamment sensibles à des stimuli physico-chimiques spécifiques. Une description détaillée de ces relations structure-fonction est cependant difficile à obtenir à partir de mesures sur des ensembles de canaux identiques, puisque les fluctuations et les distributions de différentes propriétés individuelles demeurent cachées dans une moyenne. Pour distinguer ces propriétés, des mesures à l’échelle de la molécule unique sont nécessaires.
Le but principal de la présente thèse est d’étudier la structure et les mécanismes moléculaires de canaux ioniques par mesures de spectroscopie de fluorescence à l’échelle de la molécule unique. Les études sont particulièrement dirigées vers le développement de nouvelles méthodes ou leur amélioration. Une classe de toxine formeuse de pores a servi de premier modèle d’étude. La fluorescence à l’échelle de la molécule unique a aussi été utilisée pour l’étude d’un récepteur glutamate, d’un récepteur à la glycine et d’un canal potassique procaryote.
Le premier volet porte sur l’étude de la stœchiométrie par mesures de photoblanchiment en temps résolu. Cette méthode permet de déterminer directement le nombre de monomères fluorescents dans un complexe isolé par le décompte des sauts discrets de fluorescence suivant les événements de photoblanchiment. Nous présentons ici la première description, à notre connaissance, de l’assemblage dynamique d’une protéine membranaire dans un environnement lipidique. Un algorithme est ensuite développé pour analyser les mesures de photoblanchiment, même lorsque le signal d’intérêt est fortement contaminé par le bruit de fluorescence. La méthode présentée permet une analyse rapide et automatique basée sur des critères fixes. Finalement, la fluorescence à l’échelle de la molécule unique est mesurée simultanément au courant ionique de canaux potassiques KcsA. Le principe d’association de sous-unités est amené à un degré d’oligomérisation plus important alors que les interactions et le regroupement de canaux KcsA sont étudiés en bicouche lipidique planaire. Dans ce contexte d’assemblage de canaux ioniques, les effets de l’épaisseur de la région hydrophobique de la membrane sont explorés. La fonction des canaux KcsA est aussi étudiée en présence de canaux assemblés, de même qu’en variant la composition lipidique.
